FRET System zur Visualisierung der TCR-pMHC Bindung in situ

Gezeigt ist ein Modell des FRET (F√∂rster Resonnanz Energie Transfer) Systems, welches uns erlaubt, Wechselwirkungen zwischen T Zell Rezeptoren (in blau dargestellt) auf der T Zelle und Peptid-beladenen MHC Molek√ľlen (in gelb und rot abgebildet) auf Antigen-pr√§sentierenden Zellen innerhalb der immunologischen Synapse mittels mikroskopischer Methoden zu messen. Um FRET in reproduzierbarer Weise zuzulassen, werden die Interaktionspartner mit den korrespondierenden Fluoreszenz-Farbstoffen Alexa Fluor 555 oder Cy3 (gr√ľn) und Alexa Fluor 647 oder Cy5 (rot) in seitenspezifischer Weise markiert. Da es derzeit technisch unm√∂glich ist, Zell-gebundene Rezeptoren wie z.B. den TCR seitenspezifisch mit organischen Fluorophoren zu markieren, haben wir einen TCR-reaktiven monoklonalen Antik√∂rper zu einer monovalenten Sonde umgebaut (hier hellbraun dargestellt), welche die TCR-pMHC Interaktion nicht st√∂rt und sich seitenspezifisch Fluoreszenz-markieren l√§√üt. Im TCR-pMHC Komplex befinden sich die korespondierenden FRET- Farbstoffe in einem Abstand von ~ 41 √Öngstr√∂m, was eine FRET-Effizienz von mehr als 50% zul√§√üt . Dies erm√∂glicht uns, TCR-pMHC Wechselwirkungen sowohl auf Einzelmolek√ľlebene wie auch auf Populationsebene in der immunologischen Synapse zu quantifizieren.

Das illustrierte Modell basiert auf der Struktur des TCR-pMHC Komplexes einerseits und des TCR-H57 Fab Komplexes andererseits.


 

Einzelmolek√ľl FRET-Ereignisse in der Immunologischen Synapse

 

 

Die obige Filmsequenz zeigt den FRET-Kanal einer Immunologischen Synapse zwischen einer T Zelle und einem Glass-unterst√ľtzten Bilayer. Wie in der obigen Illustration dargestellt sind Zell-assozierte TCRs mit dem H57 scFv-Cy3 als FRET-Donor dekoriert. Im Bilayer verankerte pMHCs sind im Unterschu√ü mit Cy5 markiert und dienen als FRET-Akzeptor. Einzelmolek√ľl-FRET Ereignisse erscheinen vor√ľbergehend als Lichtpunkte und repr√§sentieren einzelne TCR-pMHC Interaktionen, deren Dauer verfolgt werden kann. Der √§u√üere Rand der Cy3-markierten T Zelle leuchtet in der hier gezeigten Raw FRET Bildsequenz schwach durch.

Zeitskala: 165ms/ Bild