FRET System zur Visualisierung der TCR-pMHC Bindung in situ

Gezeigt ist ein Modell des FRET (Förster Resonnanz Energie Transfer) Systems, welches uns erlaubt, Wechselwirkungen zwischen T Zell Rezeptoren (in blau dargestellt) auf der T Zelle und Peptid-beladenen MHC Molekülen (in gelb und rot abgebildet) auf Antigen-präsentierenden Zellen innerhalb der immunologischen Synapse mittels mikroskopischer Methoden zu messen. Um FRET in reproduzierbarer Weise zuzulassen, werden die Interaktionspartner mit den korrespondierenden Fluoreszenz-Farbstoffen Alexa Fluor 555 oder Cy3 (grün) und Alexa Fluor 647 oder Cy5 (rot) in seitenspezifischer Weise markiert. Da es derzeit technisch unmöglich ist, Zell-gebundene Rezeptoren wie z.B. den TCR seitenspezifisch mit organischen Fluorophoren zu markieren, haben wir einen TCR-reaktiven monoklonalen Antikörper zu einer monovalenten Sonde umgebaut (hier hellbraun dargestellt), welche die TCR-pMHC Interaktion nicht stört und sich seitenspezifisch Fluoreszenz-markieren läßt. Im TCR-pMHC Komplex befinden sich die korespondierenden FRET- Farbstoffe in einem Abstand von ~ 41 Ångström, was eine FRET-Effizienz von mehr als 50% zuläßt . Dies ermöglicht uns, TCR-pMHC Wechselwirkungen sowohl auf Einzelmolekülebene wie auch auf Populationsebene in der immunologischen Synapse zu quantifizieren.

Das illustrierte Modell basiert auf der Struktur des TCR-pMHC Komplexes einerseits und des TCR-H57 Fab Komplexes andererseits.


 


Einzelmolekül FRET-Ereignisse in der Immunologischen Synapse

 

 

Die obige Filmsequenz zeigt den FRET-Kanal einer Immunologischen Synapse zwischen einer T Zelle und einem Glass-unterstützten Bilayer. Wie in der obigen Illustration dargestellt sind Zell-assozierte TCRs mit dem H57 scFv-Cy3 als FRET-Donor dekoriert. Im Bilayer verankerte pMHCs sind im Unterschuß mit Cy5 markiert und dienen als FRET-Akzeptor. Einzelmolekül-FRET Ereignisse erscheinen vorübergehend als Lichtpunkte und repräsentieren einzelne TCR-pMHC Interaktionen, deren Dauer verfolgt werden kann. Der äußere Rand der Cy3-markierten T Zelle leuchtet in der hier gezeigten Raw FRET Bildsequenz schwach durch.

Zeitskala: 165ms/ Bild